ISOLASI DNA, POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR), DAN DETEKSI DNA MELALUI ELEKTROFORESIS

Oleh :
Achmad Prafitdhin

JURUSAN PETERNAKAN
FAKULTAS PETRNAKAN PERIKANAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG
2009

BAB I
PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang
Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi pada akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. Beberapa bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam tanaman – padi, kapas, dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan keanekaragaman hayati dimasa mendatang memerlukan sebuah keterampilan dan pemikiran. Melalui isolasi DNA tersebut paling tidak akan menjadi pembelajaran bagi mahasiswa mengenai cara pengumpulan DNA dari darah sapi.
Pengetahuan DNA lebih ditekankan untuk hewan, – sapi – perbedaan garis pada foto menunujukkan perbedaan bangsa, tampilan fisik, dan mungkin akan mengarah kepada tampilan produksi. Praktikum isolasi DNA darah sapi memang tergolong memerlukan waktu yang relatif lama, namun sebanding dengan ilmu yang diperoleh.
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan alat yang dapat menunjang proses isoasi DNA. PCR merupakan teknik untuk mengamplifikasi DNA dalam jumlah kecil melalui proses enzimatik secara in vitro. Penggandaan yang dilakukan PCR bertujuan untuk memperbanyak jumlah DNA agar dalam isolasi dapat diperoleh DNA dalam jumlah besar. Biasanya mesin itu digunakan sebagai amplifkasi DNA mikroorganisme.
Deteksi DNA melalui elektroforesis dapat dilakukan dengan gel agarose dan gel polyacrilamide. Namun, pada praktikum kali ini menggunakan gel agarose. Karena jumlah DNA yang hanya mencapai 10 ng mampu terdeteksi oleh gel agarose. Proses elektroforesis gagal dilakukan, waktu dan arus yang terlalu tinggi ditengarahi menjadi faktor utama kegagalan tersebut.

I.2 Rumusan Masalah
Terdapat beberapa rumusan masalah pada praktikum isolasi DNA, polymerase chain reaction (PCR), dan detaksi DNA melalui elektroforesis, yaitu sebagai berikut :
1. Bagaimana cara melakukan isolasi DNA pada darah sapi?
2. Bagaimana cara kerja PCR terhadap amplifikasi DNA?
3. Bagaimana deteksi DNA melalui elektroforesis?

I.3 Tujuan
Adapun tujuannya adalah sebagai berikut :
1. Untuk mengetahui cara melakukan isolasi DNA pada darah sapi.
2. Untuk mengetahui cara kerja PCR terhadap amplifikasi DNA.
3. Untuk mengetahui deteksi DNA melalui elektroforesis.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

DNA (deoxyribonucleic acid) adalah materi genetik yang terdapat di dalam inti sel makhluk hidup. Materi itu berbentuk seperti tangga. Bukan tangga yang lurus, tetapi tangga yang berpilin. Kedua sisi tangga dihubungkan oleh anak tangga. Pada DNA, hanya ada dua jenis anak tangga, yaitu anak tangga yang dibentuk oleh pasangan basa nitrogen Adenin dan Timin (A-T) dan basa Guanin-Citosin (G-C) (Warta Medika, 2008).
Isolasi DNA dapat juga disebut sebagai ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA melibatkan penambahan beberapa bahan kimia. Pertama, sodium Dodecylsulfate (SDS) dan Proteinase Kare ditambahkan untuk membuka dinding sel sepanjang protein yang melindungi molekul DNA selagi mereka ada di dalam kromosom. Selanjutnya campuran phenol/cloroform ditambahkan untuk memisahkan protein dari DNA. DNA menjadi lebih dapat larut di dalam air yang mengandung campuran organic-aqueous. Ketika proses sentrifuge, bekas peninggalan protein dan selular yang tak dikehendaki dipisahkan dari tahap yang mengandung air dan menggandakan molekul DNA sehingga dapat ditransfer dengan baik untuk dianalisa. Beberapa protokol melibatkan dialisa centricon 100 (Millipore, Billerica, MA) dan konsentrasi di tempat timbulnya ethanol dan untuk memindahkan heme inhibitors. Sementara metoda ekstraksi bekerja dengan baik untuk recovery bobot DNA dengan molekul tinggi, ini adalah waktu menggunakan bahan kimia yang penuh resiko dan memerlukan contoh untuk ditransfer antara banyak tabung (faktanya ini menaikkan resiko kesalahan dan kontaminasi (Anonim, 2006).
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah cara in vitro untuk memperbanyak target sekuen spesifik AN untuk analisis cepat atau karakterisasi, walaupun material yang digunakan pada awal pemeriksaan sangat sedikit. Pada dasarnya PCR meliputi tiga perlakuan yaitu:denaturisasi, hibridisasi dari "primer" sekuen DNA pada bagian tertentu yang diinginkan, diikuti dengan perbanyakan bagian tersebut oleh Tag polymerase; dikerjakan dengan mengadakan campuran reaksi dalam tabung mikro yang kemudian diletakkan pada blok pemanas yang telah diprogram pada seri temperatur yang diinginkan (Prijanto, 1992).
Menurut Abdullah dan Retnoningrum (2003), teknik PCR didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik dimana terjadi penggandaan jumlah molekul DNA pada setiap siklusnya secara eksponensial dalam waktu yang relatif singkat. Teknik ini sangat ideal untuk mengidentifikasi patogen dengan cepat dan akurat. Secara umum proses ini dapat dikelompokkan dalam tiga tahap yang berurutan yaitu denaturasi templat, annealing (penempelan) pasangan primer pada untai tunggal DNA target dan extension (pemanjangan atau polimerisasi), sehingga diperoleh amplifikasi DNA antara 106-109 kali.
Untuk identifikasi dan membedakan ukuran fragmen DNA yang dipisahkan melalui elektroforesis tersebut mutlak diperlukan petanda / marker atau ladder yang disesuaikan dengan besaran suatu standar ukuran (size) DNA yang dinyatakan dalam bp (base pair). DNA marker umumnya dibuat dari hasil pemotongan suatu plasmid dengan enzym restriksi yang akan menghasilkan beberapa fragmen DNA (Soehardjo, 2003).
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp) (Anonim, 2008).
Elektroferesis adalah peristiwa pergerakan partikel koloid yang bermuatan ke salah satu elektroda. Elektrotoresis dapat digunakan untuk mendeteksi muatan partikel koloid. Jika partikel koloid berkumpul di elektroda positif berarti koloid bermuatan negatif dan jika partikel koloid berkumpul di elektroda negatif berarti koloid bermuatan positif (Anonim,2007; 2008). Penggambaran kejadian elektroforesis seperti terlihat pada gambar di bawah ini.

Gambar 1. Perpindahan molekul beruatan negatif ke arah positif.

Molekul DNA bermuatan negatif, sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet Anonim, 2008).


BAB III
METODE DAN MATERI

III.1 Waktu dan Tempat
Praktikum bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Universitas Muhammadiyah Malang, dilakukan pada tanggal 21 dan 28 Mei 2009.

III.2 Alat dan Bahan
III.2.1 Isolasi DNA
Alat :
- Centrifuge - Vacuum
- Tabung ependorf 1,5 ml - Pipet
- Box tempat menyimpan es - Tip
- Pinset - Mikropipet

Bahan :
- Tris – HCl - Ethanol 70 %
- EDTA - dH2O
- NaCl - Nonidet P40 (NP40)
- Kantung Plastik - SDS
- Chloroform - Es
- Ethanol absolute - RNAse free DNAse

III.2.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Alat :
- Mesin PCR - Vortex
- Tabung eppendorf - Tube PCR
- Mikropipet - Centrifuge
- Tabung PCR - Tip

Bahan :
- dH2O - Mg²+
- 10 X buffer PCR - Agarose
- dNTP
- DNA Taq polymerase DNA template

III.2.3 Deteksi DNA Melalui Elektroforesis
Alat :
- Microwave - pH meter
- Flask - Timbangan
- Comb - Box plastik
- Timbangan - Elektrophoresis apparatus
- Spatula - Power suplly Mikropipet
- Tray untuk mencetak gel - Tip
- Spatula - Timer
- Magnetic stirrer - Gelas ukur 1 liter
- Gelas beaker - Tabung eppendorf

Bahan :
- 1X buffer TAE (Tris Base, Acetic Acid, EDTA)
- Sampel DNA produk PCR - dH2O
- Molekuler weigt maker - Tape
- Agarose - Sucrose
- Bromophenol blue - Ethidium Bromide

III.3 Cara Kerja
III.3.1 Isolasi DNA
1. Siapkan tabung ependorf 1,5 ml, darah sapi/domba dimasukkan dengan volume 500 μl.
2. Siapkan buffer pengekstrak DNA, larutan yang digunakan untuk ekstraksi DNA sel darah sapi adalah : Larutan I (10 mM Tris pH 7,6; 10 mM KCl; 10 mM MgCl2), Larutan II (10 mM Tris pH 7,6; 10 mM KCl; 10 mM MgCl2 + 0,5 M NaCl; 0,5% SDS; 2 mM EDTA), larutan Nonidet P40 (NP40)
3. Tambahkan 500 μl Larutan I ke dalam tabung ependorf yang telah terisi darah
4. Campurkan dengan cara dibolak-balik sampai campuran larutan tampak encer/jernih
5. Tambahkan larutan 12 μl NP 40 lalu balik-balik secara perlahan
6. Campurkan dengan cara dibolak-balik sampai homogen
7. Lakukan sentrifuse suspensi (point 6) pada kecepatan 2000 rpm, 10 menit, suhu 4ºC, lalu supernatant dibuang.
8. Tambahkan 200 μl larutan II, lalu campurkan hingga pellet larut
9. Tambahkan fenol 40 μl, dan lakukan vortex
10. Lakukan sentrifugasi selama 2 menit pada kecepatan 12.000 rpm
11. Ambil Supernatan
12. Tambahkan 20 μl chloroform, isoamil alcohol (24:1), lalu lakukan vortex
13. Lakukan sentrifugasi selama 2 menit pada kecepatan 12.000 rpm
14. Ambil lapisan paling atas, lalu masukkan ke tabung ependorf baru
15. Tambahkan 40 μl chloroform, isoamil alcohol (24:1), lalu dilakukan vortex
16. Lakukan sentrifugasi selama 2 menit pada kecepatan 12.000 rpm
17. Ambil Supernatan
18. Tambahkan 2 volum ethanol absolute (96%) dingin, tabung dibolak-balik dengan hati-hati, benang-benang diamati (warna putih kekuningan)
19. Lakukan sentrifuse kembali selama 5 menit, kecepatan 12.000 rpm, suhu 4ºC, suoernatan dibuang (hati-hati jagnan sampai DNA ikut terbuang)
20. Cuci Pellet DNA dengan 100 μl ethanol 70%
21. Lakukan sentrifuse kembali selama 5 menit, kecepatan 12.000 rmp, suhu 4ºC, supernatant dibuang (hati-hati jangan sampai DNA ikut terbuang)
22. Keringkan Pellet DNA dengan vacuum/aspirator
23. Larutkan DNA dengan 25 μl TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0 dan 1 mM NaEDTA pH 8,0)
24. Simpan DNA hasil isolasi pada suhu -20ºC

Tahap Purifikasi
1. DNA hasil ekstraksi ditambahkan 2 µl RNAse konsentrasi 10 µl/ml atau 10 mg/ml
2. Inkubasi pada suhu 37ºC selama 30 menit
3. Tambahkan TE 7,5 µl
4. Tambahkan phenol 7,5 µl dan 7,5 µl Chloroform kemudian vortex
5. Sentrifugasi selama 5 menit, dengan kecepatan 10.000 rpm, menggunakan suhu 4ºC, lalu ambil supernatant
6. Tambahkan phenol 7,5 µl dan 7,5 µl Chloroform kemudian vortex
7. Sentrifugasi lagi selama 5 menit, dengan kecepatan 10.000 rpm, menggunakan suhu 4ºC, lalu ambil supernatant
8. Tambah dengan 30 µl etanol absolute (96%) dingin, bolakbalik tabung secara hati-hati
9. Sentrifugasi selama 5 menit, dengan kecepatan 10.000 rpm, menggunakan suhu 4ºC, lalu ambil supernatant
10. Tambah dengan 75 µl ethanol 70% (dingin), bolak-balik tabung secara hati-hati
11. Sentrifugasi selama 5 menit, dengan kecepatan 10.000 rpm, menggunakan suhu 4ºC, lalu ambil supernatant
12. Keringkan pellet DNA dengan vacuum/aspirator selama 20 menit
13. Larutkan DNA dengan 25 µl TE (10mM Tris-HCl pH 8,0 dan 1 mM NaEDTA pH 8,0)
14. DNA disimpan pada suhu 4ºC

III.3.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)
1. Larutkan DNA genomic hasil isolasi sehinga didapatkan konsentrasi sebesar 10 ng/µl
2. Buat larutan PCR yang terdiri atas :
a. 3 µl template DNA (10ng/µl)
b. 2,5 µ 10X buffer PCR
c. 1 µl mixed dNTP
d. 0,5 µl masing-masing primer (5 µM)
e. 0,1 µl DNA taq polymerase (5U/µl)
f. 18 µl dH2O
3. Campurkan PCR mix solution menggunakan vortex
4. Spin PCR mix solution menggunakan centrifuge
5. Masukkan masing-masing tabung yang berisi larutan PCR ke dalam mesin PCR
6. Lakukan pengesetan program PCR
7. Setelah reaksi PCR selesai (± 3 jam), ambil tabung yang berisi larutan PCR dari dalam mesin PCR
8. Sampel hasil PCR dapat disimpan pada suhu 4ºC untuk disimpan atau dapat digunakan langsung.

III.3.3 Deteksi DNA Melalui Elektroforesis
1. Menutup bagian samping tray dengan menggunakan karet penutup
2. Memanaskan gel agarose 0,8% dengan menggunakan microwaxe sampai mencair sempurna
3. Menunggu larutan agarose agak dingin
4. Menuangkan larutan agarose ke dalam tray, dan hindari gelembung udara
5. Memasukkan Comb ke dalam agarose
6. Setelah agarose menjadi gel dengan sempurna (paling cepat 15 menit), karet dan comb dilepas dengan hati-hati agar gel tidak patah. Gel agarose siap untuk digunakan untuk melakukan electrophoresis
7. Memasukkan gel agarose yang telah beku ke dalam electrophoresis apparatus
8. Memasukkan buffer electrophoresis (TBE 1X) ke dalam electrophoresis apparatus hingga gel terendam
9. Membuang gelembung udara dalam wwell dengan menggunakan mikropipet
10. Menambahkan 0,2 vol buffer loading ke dalam masing-masing sample DNA yang akan diuji
11. Dilakukan Votex dan spain dengan kecepatan maksimum
12. Loading dengan hati-hati setiap sample DNA ke dalam well, hindari DNA sample keluar well
13. Selain itu loading juga control negative (larutan PCR tanpa sample DNA ), control positif (larutan PCR dengan sample DNA yang dapat teramplifikasi) dan moleculas weigt marker
14. Menyalakan power supply. Kondisi elektroforesis adalah 75 mA
15. Proses elektroforesisi berlangsung selama ± 90 menit
16. Setelah proses elektroforesisi selesai, gel diangkat dari apparatus
17. Gel direndam dalam larutan ethidium bromide pada plastic box
18. Meletakkan gel pada box shaker, diamkan 20 menit
19. Setelah selesai, keluarkan gel dari elektroforesis apparatus
20. Cuci gel dengan air selama 15 menit untuk menghilangkan kelebihan ethidium bromide pada gel
21. Gel siap diamati / diambil fotonya.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Isolasi DNA
Tahapan praktikum isolasi DNA dan PCR dilakukan dalam satu waktu percobaan. Isolasi DNA memerlukan waktu yang ralatif lama. Praktikum tersebut kurang lebih membutuhkan waktu enam jam.
Isolasi DNA berhasil dilakukan hingga menghasilkan ± 10 ng/µl (3 µl template DNA). Berikut ini adalah gambar proses isolasi DNA, terlihat pada tabung eppendorf.

IV.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Proses pengamplifikasian DNA pada PCR juga berhasil dilakukan. Setelah berhasil dalam amplifikasi, DNA di simpan dalam freezer dengan suhu 4ºC sampai isolat DNA di deteksi dengan elektroforesis.
DNA pada mulanya utuh dengan memiliki dua pita melilit satu dengan lainnya. Tahap amplifikasi oleh PCR menyebabkan pita DNA mengalami denaturasi (DNA template memisah menjadi utas tunggal). Tahap ini membutuhkan suhu 94ºC. Tahapan selanjutnya adalah primer DNA menempel pada sekuen DNA target, dalam fase annealing ini suhu yang dipergunakan adalah 55-65ºC. Tahap ketiga yaitu elongasi (pemanjangan), primer DNA yang menempel pada sekuen tersebut memanjang sampai mencapai binding site dari pasangang primer lainnya. Suhu yang digunakan pada tahap ketiga tersebut yaitu 72ºC

IV.3 Deteksi DNA Melalui Elektroforesis
Perpindahan molekul DNA dari medan listrik negatif ke arah positif. Cara deteksi DNA pun dengan menggunakan media gel agarosa. Isolat DNA sebelum dimasukkan ditambahkan bahan kimia berupa bhromophenol blue agar warnanya memudahkan pemindaian.
Berikut ini adalah alat elektroforesis (Electrophoresis apparatus) sebagai pemisah molekul DNA positif dan negatif, hasil pemisahan tersebut terlihat pada gel agarose di bawah ini.

Foto berikut ini diambil menggunakan kamera Ultra Violet (UV). Namun akibat waktu perendaman yang terlalu lama pada TBE 1X dengan alat elektroforesis maka DNA gagal berada di gel agarose. DNA terus menembus gel tersebut hingga keluar dari gel. Akibatnya tidak ada satu pun garis cahaya yang muncul pada gel.

Hasil foto Ultra Violet tidak menunjukkan garis-garis pencahayaan, maka proses elektroforesis telah gagal dilaksanakan. Proses yang terlalu lama yaitu 90 menit dengan arus listrik 75 mA ditengarahi menjadi penyebab kegagalannya.
Waktu yang paling optimal dalam elektroforesis yang sebenarnya adalah 30 – 50 menit dengan menggunakan arus 50 mA.

BAB V
KESIMPULAN

Terdapat beberapa kesimpulan dari kegiatan praktikum kali ini. Isolasi DNA berhasil dikerjakan. Tahapan amplifikasi DNA dengan PCR terbagi dalam tiga tahap, yaitu denaturasi, annealing, dan elongasi berhasil dikerjakan. Deteksi DNA menggunakan elektroforesis gagal dilakukan. Foto dengan menggunakan sinar UV gagal memindai pencahayaan yang seharusnya ada di dalam gel. Seharusnya terdapat lima garis dalam gel (sesuai jumlah kelompok). Garis pada gel agarosa yang diharapkan tidak muncul. Hal ini menandakan kegagalan proses deteksi DNA dengan elektroforesis.


DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2006. Pengumpulan Sampel, Ekstraksi DNA, dan Kuantifikasi DNA (http://www.freewebs.com/pengumpulansampeldna/index.htm). Diakses 2 Juni 2009.

Anonim. 2008. Elektroforesis Gel Agarosa (http://02bios2unsoed.wordpress.com/ tentang/acara-praktikum/3-gel-elektroforesis-dna/). Diakses 3 Juni 2009.

Anonim. 2008. Elektroferisis Dan Dialisis. (http://www.vlsm.org). Diakses 6 Juni 2009.

Anonim. 2007. Elektroforesis. (http://kimia.upi.edu/utama/bahanajar/kuliah_web/ 2007/Winiati%20%28044482%29new/1.html). Diakses 6 Juni 2009.

Abdullah, Chainulfiffah dan Retnoningrum, Debbie S. 2003. Deteksi Bakteri Patogen Streptococcus pyogenes dengan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Jurnal Natur Indonesia.

Prijanto, Muljati. 1992. Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Diagnosis Human Immunodeficiency Virus (HIV). (http://www.pcr.htm). Diakses 6 Juni 2009.
Soehardjo, Indrayana Noto. 2003. PCMV-b-Gal Sebagai Bahan Baku Pembuatan Marker DNA yang Mudah dan Murah. (http://www.adln.lib.unair.ac.id/). Diakses 3 Juni 2009.
Warta Medika. 2008. Sidik DNA. (http://www.wartamedika.com/2008/07/sidik-dna.html). Diakses 3 Juni 2009.